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本制品是粉末形式的Calcein-AM，超纯级别(≥95%)，可与碘化丙啶染液(1mg/mL)(货号：SY0491)联合使用，用于活细胞和死细胞的同时检测。或者直接购买我司提供的活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/PI)(货号：SY0501)。

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光(Ex=490nm，Em=515nm)。因其在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein,AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein,AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。作为核染色染料的碘化丙啶不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：535nm，发射：617nm)，因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein,AM和PI经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein,AM和PI的合适浓度。

中文名称	3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基荧光素，二乙酰甲酯；钙黄绿素乙酰甲酯；
英文名称	3',6'-Di(O-acetyl)-4',5'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein,tetraacetoxymethyl ester
CAS号	148504-34-1
分子式	C46H46N2O23
分子量	994.86
纯度	≥95%(HPLC)
光谱特性	Ex/Em=490/515nm
结构式

• 对于微量试剂，开封前，请稍微离心一下，以保证粉末落入管底。
  
• 由于Calcein-AM对湿度非常敏感，本粉末保存的过程中一定要保持干燥。对于配制好的Calcein-AM储存液需要分装冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 储存液的配制
  本制品是以粉末形式提供的，根据工作液的浓度将其配制成1000×的储存液，储存液配制范围可为1～50mM。例如使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，也就是向50μg Calcein-AM(Mw：994.86)内加入10μL细胞培养级别的DMSO即可得到所需浓度的储存液。
  
• 染色步骤
  对于大部分细胞，Calcein-AM的工作液浓度为2～5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
  
  • 使用时，取一管适量的Calcein-AM储存液(1000×)，用PBS(或Hanks和Hepes)缓冲液将其稀释成相应浓度的染色工作液。
    注：有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F-127(货号：SY0881)到Calcein-AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用的Calcein-AM储存液内加入等体积的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。含Pluronic F127的Calcein-AM溶液不可长期保存，现配现用。
    
  • 对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞(1000rpm，3min)。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。
    
  • 去上清，用PBS(或者其他缓冲液)充分清洗细胞2～3次，以充分去除残留的酯酶活性。
    
  • 用1/10细胞培养基体积的Calcein-AM染色工作液重悬细胞，37℃培养细胞15～30分钟。
    注：如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒(probenecid，1～2.5mM)或者苯磺唑酮(sulfinpyrazone，0.1～0.25mM)到孵育体系内以降低去酯化染料calcein泄露到胞外。
    
  • 用PBS(或者其他缓冲液)洗涤细胞两次去除多余的染料。
    注：如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗
    
  • 用含490nm激发波长，515nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。